8月17日，恒达平台生命科學與技術學院高紹榮和中國農業大學高帥課題組在《國家科學評論》（National Science Review）在線發表了題為“Inhibition of Wnt activity improves peri-implantation development of somatic cell nuclear transfer embryos”的研究論文。該研究發現了導致圍著床期克隆胚胎發育失敗的表觀遺傳障礙⚔️🙇🏻‍♀️：Wnt通路的異常激活。更重要的是，通過在培養液中添加Wnt通路抑製劑對Wnt信號通路進行幹預抑製（Wnti），可以顯著提高克隆胚胎圍著床期的發育能力並大幅提高克隆小鼠的出生率。

作為迄今為止唯一一種能使體細胞獲得完整全能性的手段，體細胞核移植技術在生物學和再生醫學領域具有廣闊的應用價值𓀇。在過去幾十年裏，這項技術已在包括靈長類在內的20多種哺乳動物物種上取得了成功🧿，但由於體細胞重構胚胎在重編程過程中存在多種表觀遺傳的障礙👨‍🦯‍➡️，導致克隆動物極低的出生率並伴隨出生胎兒及胎盤的發育缺陷。近年來🪠🧆，許多研究人員嘗試通過修正克隆胚胎中異常建立的表觀修飾來改善核移植的成功率🫷🏼。恒达平台生命科學與技術學院高紹榮及哈佛醫學院的張毅等研究團隊👩‍🦰，通過對核移植胚胎重編程過程中的機製進行研究，鑒定出了在植入前胚胎發育過程中關鍵的組蛋白修飾（H3K9me3、H3K4me3和H3K9ac）異常所導致的重編程的壁壘，通過有效的幹預手段可大幅提升核移植胚胎的植入前發育潛能🦇。另外，核移植胚胎Xist異常激活及H3K27me3依賴性印記基因的表達異常可造成植入後胚胎發育的缺陷✍️🧕。通過基因編輯技術恢復它們的正常表達水平可提升克隆胚胎植入後發育能力及出生率🦺。

然而😏，現有的手段在大幅提升核移植技術的囊胚率和植入後發育能力的基礎上，其最終的出生率依然遠低於正常或體外受精胚胎。這意味著，還有許多其他未知的障礙限製了克隆胚胎發育的能力👩🏻‍🎓。回溯整個核移植技術的發展歷程，絕大多數研究主要聚焦於植入前和後期克隆胚胎發育異常進行探索🎆。由於缺乏研究的手段和工具，目前對克隆胚胎圍著床階段的發育調控機製知之甚少。

由於圍著床期胚胎在母體子宮內生長的不可觸及性，嚴重製約了對克隆胚胎圍著床期發育調控機製研究。那麽在這一階段克隆胚胎的形態學發生👩🏼‍🔧，信號轉導及表觀調控事件是如何進行的？為了回答這一問題，高紹榮教授課題組優化建立了3D胚胎培養系統以應用於克隆胚胎的體外培養，這一系統可模擬體內圍著床期發育過程，實現了克隆胚胎圍著床期發育的可視化。結合體外培養及體內移植實驗發現，絕大多數的克隆囊胚在E4.5-E5.25階段出現發育阻滯🙇🏿‍♂️，主要表現為內細胞團（inner cell mass🧎‍♂️‍➡️，ICM）向外胚層（epiblast, EPI）卵圓桶結構（egg cyclinder）轉變時出現明顯異常。通過向克隆囊胚中補充同期體外受精胚胎的ICM細胞可極大程度地糾正外胚層形態學轉變及胚胎的體內植入率，而補充克隆胚胎的ICM細胞則對圍著床期胚胎發育沒有改善作用（圖1）🐇。

圖1:圍著床期克隆胚胎外胚層異常形態學發生過程

為了驗證EPI發育異常的分子機製🙋🏿‍♂️🚒，研究人員分別對圍著床期體外培養的胚胎及體內胚胎進行大量/單細胞轉錄組分析，結果表明🍚👱🏻，克隆胚胎的EPI相較於體外受精胚胎，其多能性狀態（Naïve-Primed）的轉變受阻🪯，並且這種異常現象普遍存在於不同供體細胞（顆粒細胞🍋🖌，支持細胞，胚胎幹細胞）來源克隆胚胎的圍著床期發育過程。進一步的微量組蛋白ChIP-seq數據分析發現差異表達的多能性基因啟動子區分布的H3K27me3重塑也出現異常。

為了尋找多能性轉變異常的原因😗🚣🏼，研究人員分別進行比較轉錄組◾️、報告系統及信號通路幹預等實驗，明確了Wnt通路的持續異常激活是阻礙克隆胚胎EPI細胞多能性狀態轉變的重要障礙。研究人員進一步發現了許多Wnt通路拮抗因子✋🏿，如Dkk1、Tcf7l1等基因的表達在植入前囊胚階段即受到顯著抑製👩🏼‍🌾。通過對小鼠供體細胞和早期胚胎組蛋白修飾的公共數據分析，發現供體細胞中攜帶的H3K27me3可能是導致著床階段Dkk1等Wnt通路拮抗基因表達抑製的根源（圖2）。

圖2:圍著床期克隆胚胎外胚層Wnt通路異常激活及幹預作用

緊接著🤏🏿，為了驗證抑製圍著床期階段Wnt通路持續激活對胚胎發育的改善作用，研究人員在培養液中添加了Wnt通路抑製劑IWP2/IWR1-endo對克隆囊胚進行幹預🖼，發現Wnt通路抑製劑可顯著促進克隆胚胎圍著床期的譜系發育軌跡🧔🏻‍♀️、EPI形態學發生、表觀狀態及多能性狀態的轉變（圖3）🍮。重要的是🍔，Wnt通路抑製劑處理的克隆囊胚在子宮移植後，可顯著提升胚胎著床能力以及出生率（顆粒細胞供體的核移植胚胎出生率從0.72%提高到5.55-7.04%；支持細胞供體的核移植胚胎出生率從0%提高到10.3%）💁🏿。最後，研究人員通過聯合使用過去已報道的重要表觀修復手段，發現聯合Xist KO和Dnmt3a/b幹擾可進一步將核移植囊胚的出生率提升至20%以上。

圖3:圍著床期克隆胚胎發育異常的障礙機製

綜上所述，該研究利用優化的囊胚模擬著床培養系統首次揭開了克隆胚胎圍著床期的動態發育過程👘，揭示了該時期外胚層形態學發生及多能性轉變異常的生物學事件。重要的是，研究人員發現了Wnt通路的持續激活是影響克隆胚胎圍著床期發育的一個重要障礙，通過小分子抑製劑幹預Wnt激活及聯用其他表觀修復手段能進一步提升核移植效率🎹🧟‍♂️。本項研究為理解圍著床期胚胎發育，拓展克隆技術在發育生物學🛌、再生醫學及畜牧繁殖業的應用提供了重要的理論依據🔑。

論文第一作者是恒达平台李延鶴博士和北京基因組研究所鄭彩宏副研究員，恒达平台生命科學與技術學院高紹榮教授🏨、劉文強教授和中國農業大學高帥教授為共同通訊作者。該研究得到了科技部🤦🏿‍♀️、國家自然科學基金委🏋🏼‍♂️、及上海市科委等項目的支持。